生物传感器采用硅工艺

普渡大学Birck纳米中心（BNC, 印第安纳州West Lafayette）的任务之一就是将微米及纳米技术与生物技术结合，为生物和医疗领域的难题设计全新的解决方案。这个占地面积为187,000平方英尺的中心竣工于2005年，拥有面积为25,000 平方英尺的Scifres纳米制造实验室，清洁级别为每立方英尺1、10和100个微颗粒，以及一些电子和生物材料表征实验室。在这里，来自不同学科的团队一起工作，涵盖了电子和生物工程、生物科学、食品科学和农业领域，共享设备并开发新的概念。其中一个非常有趣的领域是采用微电子和硅工艺加工基于芯片的诊断设备。
        
与硅工艺不同，自然界通常是用化学和生物自组装工艺自下而上地完成纳米及纳米以下尺度的生物实体（图1）。比如，病毒的尺寸在0.1 μm的量级或者更小，DNA的直径为2-3 nm。随着芯片图形大小逼近45 nm,“有可能制作与生物组元大小基本相同的结构，如蛋白质、病毒和DNA，”电子与计算机工程和生物医学工程教授以及BNC集成生物医学微/纳技术和应用中心（LIBNA）主任Rashid Bashir这样介绍。他们的一项成果是就是制作出可以检测和探测单个分子探测器，其灵敏度比目前市面上所有的探测器高几个数量级。

利用已成熟的硅工艺制作这些诊断探测器，还具有可能大规模生产和缩减成本的优势。由于大肠杆菌和其他细菌向水供应场所和蔬菜种植区的传播，当前迫切需要利用操作简单的传感器对环境和食品生产场所进行及时检测，此外还有个人急救应用。



1.  硅芯片产业的进步使制作与生物组元（如蛋白质、病毒和DNA）相同尺度的探测器成为可能。
       
识别细菌
        
Bashir表示，在确定特殊细菌的存在方面，该工程与其他芯片上实验室工程不同，其特色之一就是采用了真正的多学科方法，功能和通用性都得到了提升。微流体器件一般具有横截面积很小的沟道——样品流过的沟道直径一般为几微米到几十微米。这种沟道几十分钟内可以处理几十到几百微升的流体。对于像饮用水测试这样的实际检测来说，目前的标准要求测试100 mL或更多的水样。如此多的样品需要花费数天的时间才能全部流过微流体芯片。LIBNA与具有生物医学工程和农业背景的合作者们一道开发了新型过滤设备，通过芯片浓缩放法将大体积流体浓缩为小体积流体。然后再将这些小体积流体注入芯片，在芯片中利用电子和机械过滤器进一步浓缩样品。
        
有种基于细菌和抗体的基本特征的微米级过滤方法，它利用电泳效应捕捉细菌。细菌拥有电学和介电特性，具有一定的介电常数。抗体是蛋白质，可以识别和捕获生长在其表面的特定细菌。将抗体固定在某一表面上，就可以识别和收集特定细菌。
        
电泳是指颗粒的移动，比如，位于交流电场中的目标细菌，当它与周围微粒的介电常数不同时，就会发生电泳。要使电泳发生，电场必须在空间上不均匀，在样品中形成不均匀的偶极子。然后形成一股净力（电泳力），这种力可用来浓缩或捕捉通过芯片微沟道流体中的细菌。抗体附于微沟道的内表面，用于捕获和识别目标细菌。
        
芯片中的细菌培养皿
        
快速探测活细菌是一个大难题。目前一般在装有琼脂的细菌培养皿中完成活细菌探测。细菌培养皿是一种培养基。细菌数量一般每20-40分钟翻一倍，需要几天的时间才能达到探测所需的菌落的细菌数量。LIBNA已发明一种降低探测下限、仅需少许细菌的方法，对细菌数目的要求减小了几个数量级。
        
生长期间，细菌会吸收特定的营养物质，如葡萄糖和糖类，分泌带离子化和酸性的排泄物。这些离子化的排泄物会导致培养基的电阻、电导和阻抗发生变化。根据这个原理，研究团队开发了芯片上的细菌培养基（图2），利用纳升体积沟道浓缩细菌后，这种培养基利用电极和微流体沟道监控芯片上的细菌生长。这种芯片检测电流的变化，将其看作时间的函数。一到两次重复周期后完成测试，将细菌生长时间从几天减少到20-60分钟。
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2.  芯片上细菌培养基用于培养细菌，通过流体和电气连接提供生长细菌所必须的营养物质。
        
这种芯片上细菌培养基是一个模块，包括一个安装于PCB上的面积约为1 × 1英寸的微流体芯片，以及电气和流体接口。整个模块被置入一个盒子，和电过滤模块一样，用于浓缩大量流体。
        
DNA排序
        
几乎每种医疗难题和每种疾病的根源都来自DNA的不规则排序。DNA有四种碱基A、T、G、C，它们以不同的顺序重复排列。人类所有细胞的序列都不随时间变化。相关的DNA信息被转译成蛋白质，蛋白质又执行不同的功能。排序突变可能会导致疾病，如癌症。因此获得DNA序列的信息很重要。Bashir领导的小组再次应用硅相关的纳米技术，检测DNA分子短链的序列将电子束光刻、电子束诱导融化氧化层以及聚焦离子束（FIB）结合运用，在氧化硅膜中形成纳米孔沟道。将最小直径分别为5到20 nm的一条沟道放置在硅芯片上的薄膜中。该薄膜隔开两部分流体，这两部分之间的唯一路径是纳米沟道。当一个DNA分子放入流体，如磷酸盐缓冲液溶液，它带一个单位负电荷。因此，当在带负电的流体上施加电场时，DNA会朝着正电极移动，该现象称作DNA的电泳（图3）。



3.  DNA分子流过位于两块薄膜之间20 nm的纳米孔沟道（TEM），并在沟道中被识别（示意图）。
        
为提高这种技术的选择性，研究人员利用DNA的一种重要性质——互补链结构。也就是可以用其互补链识别某个序列。碱基A与碱基T配对，而碱基G与碱基C配对。因此，若某个未知序列与一个称为检测序列的互补序列配对，则可以识别这个未知序列。
        
将DNA的短序列粘附到纳米沟道的内部，该沟道呈圆柱形，两边为二氧化硅，其上附有检测分子。未知DNA置于薄膜的一侧，在薄膜两侧施加5-300 mV的电压。单个DNA会穿过沟道，沟道的直径足够小，一次只允许一个分子穿过。
        
当目标DNA没有穿过沟道、来自氯化钾培养基的离子流过沟道时，可测量到大小为几十到几百皮安的电流。但是，特定的DNA穿过沟道时，它会截断背景离子电流。这时出现一个下降脉冲，表明电流突然下降。电流的扰动代表分子的运输。Bashir小组发现在这些功能性纳米沟道中，可通过上述迁移事件的脉冲宽度来确定目标DNA链的序列。当脉冲宽度较短时，附在纳米沟道内部的分子可以识别目标分子。
        
这种方法与直径约为10 µm的细胞的计数方法很相似。但是，使这种技术功能强大的原因是纳米孔沟道具备更强的选择性。这是有关单分子固态硅基DNA传感器的第一次报道，这种传感器利用具有选择性和提供选择性和序列信息的纳米沟道。
        
利用硅工艺开发生物诊断工具前路漫漫。LIBNA将不断有新的研究出现，比如芯片上的绝缘体上硅（SOI）晶体管，用于探测DNA和蛋白质，以及附有能捕获目标病毒的抗体的硅悬臂。所有这些都展示了一个前景光明的领域，该领域对快速、简单和易操作的探测器的要求引起人们越来越多的兴趣。